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    Preparação dos arquivos de entrada para DM

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    Análise do modelo: pdb4amber

    Em primeiro lugar, vamos analisar o modelo gerado para verificar se algum ajuste é necessário. Para isso, vamos usar o programa pdb4amber.

    O pdb4amber é um programa distribuído gratuitamente com o pacote de software livre para dinâmica molecular AmberTools14, disponível aqui. Esse programa vai analisar o arquivo, remover águas e hidrogênios, reordenar os átomos e separar quaisquer resíduos extras. Para fazer essa análise, dê o comando (as flags -y e -d servem para remover hidrogênios e água, respectivamente):
    $ pdb4amber -i ns3ns2b.pdb -o ns3ns2b_clean.pdb -y -d &> pdb4amber.log
    Para ver os resultados, abra o arquivo pdb4amber.log, gerado pelo programa. Note que o programa ainda localizou um resíduo (GLU_64) que, aparentemente estava repetido, e removeu sua segunda aparição. Emite também um aviso sobre uma distância grande entre os resíduos ASP_39 e GLY_40, que não é problema: estes são exatamente o último resíduo da NS2b e o primeiro da NS3. O mais importante para nós é que ele chama a nossa atenção para a existência de 4 histidinas, que precisam ter seu estado de protonação verificado cuidadosamente. O próximo passo agora será determinar o estado de protonação destas histidinas:

    ---------- Histidines (Renumbered Residues!)
    The following 4 histidines are found in the PDB file:
    HIS_23
    HIS_88
    HIS_92
    HIS_101
    If HIS, Amber will consider them as HIE (epsilon-HIS) by default.
    You might need to check their tautomerism or protonation state
    and change them to HID (delta-HIS) or HIP (protonated HIS)
    Vamos agora tentar determinar o estado de protonação desses resíduos.

    Determinação do estado de protonação das histidinas

    Para determinar o estado de protonação das histidinas, vamos utilizar o servidor online H++, aqui, (disponibilizado pelo grupo do Prof. Alexey Onufriev, da Virginia Tech) que analisa as regiões em torno das histidinas e determina o estado de protonação mais provável de acordo com o pKa e pH do ambiente.
    1. Carregue a página do H++, aqui;
    2. No menu do lado esquerdo, clique “Process a Structure”;
    3. Para fazer o upload do arquivo gerado na última etapa, clique em “Selecionar arquivo”, e selecione o arquivo ns3ns2b_clean.pdb.
    4. Clique em “Process File”
    5. Na próxima página, vamos verificar a estrutura e os parâmetros a serem usados, dentre os quais está o pH do ambiente. Normalmente, o H++ descobre o pH do ambiente baseado em informações no próprio arquvo PDB. No entanto, como o arquivo que usamos só contém as estruturas, tais informações não estão presentes, e precisamos informar ao sistema qual o pH no qual o sistema estará. A estrutura cristalina inicial foi obtida a pH 6,8 (veja “REMARK 200 EXPERIMENTAL DETAILS” no arquivo original) , que é condizente com o pH encontrado no interior das células. Assim, vamos usar o pH 6,8. Os demais parâmetros, vamos deixar como estão (padrão).
    6. O H++ cria arquivos para o uso com o AMBER com solvente implícito, e nos dá a opção de criar arquivos para cálculos com solvente explícito. Com nós vamos fazer essa parte manualmente, então vamos deixar a opção para criar a caixa de solvente como “No”.
    7. Finalmente, clique na seta “PROCESS”. Após alguns minutos, teremos o resultado. Para abrir, clique em "VIEW RESULTS".
    Os cálculos estão terminados, e você verá uma tela contendo os resultados. Ao lado esquerdo estará um quadro mostrando os resíduos ionizáveis e o valor do pK½ calculado para cada um, o pH no ponto central da curva de titulação. Para os resíduos que estamos interessados, temos:
    Cadeia Resíduo pK½ Estado
    A HIS 23 4,7 HIE
    B HIS 88 1,4 HID
    B HIS 92 8,3 HIP
    B HIS 101 6,1 HIE

    Baseados no valor de pK½, vemos que apenas a His92 deve estar protonada em pH 6,8, enquanto as outras devem estar neutras. Para saber se o próton estará na posição epsilon ou delta, o H++ analisa o ambiente em torno do próton. Note que o H++ não dá o estado nesta tela - é necessário ver o arquivo prmtop gerado para descobrir qual o estado escolhido.

    O H++ agora lhe dá a opção de fazer o download dos arquivos de topologia e coordenadas para o AMBER em ambiente de solvente implícito, mas isso não será necessário. Vamos apenas utilizar os nomes de resíduo de acordo com as sugestões do H++. Para isso, localize as histidinas no arquivo PDB e substitua os nomes HIS por HIE, HID out HIP, conforme a tabela.

    Preparo dos arquivos de entrada

    Finalmente, temos um arquivo PDB com as informações estruturais necessárias para o cálculo de dinâmica molecular. No entanto, esse arquivo não contém água ou contra íons. Além disso, ainda precisaremos de um arquivo de "topologia", contendo os parâmetros a serem usados pelo campo de forças. Vamos gerar esses arquivos com o auxílio do programa LEaP, parte do pacote AmberTools:
    $ tleap
    > source leaprc.ff14SB Carrega o campo de forças
    > loadAmberParams frcmod.ionsjc_tip3p Carrega os parâmetros para a água
    > ns3 = loadPdb ns3ns2b_final.pdb Carrega as coordenadas
    Loading PDB file: ./ns3ns2b_final.pdb
    Added missing heavy atom: .R<GLU 13>.A<OE1 12>
    Added missing heavy atom: .R<GLU 13>.A<OE2 13>
    Added missing heavy atom: .R<CASP 39>.A<OXT 13>
    total atoms in file: 1600
    Leap added 1581 missing atoms according to residue templates:
    3 Heavy
    1578 H / lone pairs

    Podemos agora checar a unidade recém-criada, ns3. Se houver algum problema com a estrutura, o LEaP deve avisar:
    > check ns3					Checa a unidade ns3
    Checking 'ns3'....
    WARNING: The unperturbed charge of the unit: -3.000000 is not zero.
    Warning: Close contact of 1.317344 angstroms between .R<ILE 71>.A<HD13 17> and .R<ILE 71>.A<H 2>
    <snip>
    Checking parameters for unit 'ns3'.
    Checking for bond parameters.
    Checking for angle parameters.
    check: Warnings: 6
    Unit is OK.
    A maioria dos avisos diz respeito a átomos que estão muito perto uns dos outros, e pode ser ignorada com segurança. A minimização de energia na próxima etapa cuidará desses contatos. O primeiro aviso é importante: nos diz que a molécula não é neutra, mas possui uma carga de –3. Para neutralizar essa carga, vamos adicionar contra-íons (Na+) ao sistema:

    > addIons ns3 Na+ 0
    3 Na+ ions required to neutralize.
    Adding 3 counter ions to "ns3" using 1A grid
    Grid extends from solute vdw + 1.37 to 7.37
    Resolution: 1.00 Angstrom.
    grid build: 0 sec
    (no solvent present)
    Calculating grid charges
    charges: 4 sec
    Placed Na+ in ns3 at (20.46, 7.69, 9.90).
    Placed Na+ in ns3 at (32.46, -19.31, 41.90).
    Placed Na+ in ns3 at (38.46, -31.31, 0.90).
    Done adding ions.
    Agora que o sistema está neutro, podemos adicionar o solvente. Vamos fazer um caixa octaédrica, na qual todas as paredes estão a um mínimo de 10Å da enzima:

    > solvateOct ns3 TIP3PBOX 10.0 0.75
    Scaling up box by a factor of 1.278678 to meet diagonal cut criterion
    Solute vdw bounding box: 47.045 60.582 49.055
    Total bounding box for atom centers: 86.156 86.156 86.156
    (box expansion for 'iso' is 37.0%)
    Solvent unit box: 18.774 18.774 18.774
    Volume: 331020.959 A^3 (oct)
    Total mass 180662.866 amu, Density 0.906 g/cc
    Added 8762 residues.
    Finalmente, podemos salvar os arquivos:

    > saveAmberParm ns3 ns3.prmtop ns3.inpcrd 
    Checking Unit.
    Building topology.
    Building atom parameters.
    Building bond parameters.
    Building angle parameters.
    Building proper torsion parameters.
    Building improper torsion parameters.
    total 624 improper torsions applied
    Building H-Bond parameters.
    Incorporating Non-Bonded adjustments.
    Not Marking per-residue atom chain types.
    Marking per-residue atom chain types.
    (Residues lacking connect0/connect1 -
    these don't have chain types marked:
    res total affected
    CALA 1
    CASP 1
    NASP 1
    NGLY 1
    WAT 8762
    )
    (no restraints)
    > quit
    Verifique no diretório a presença dos arquivos ns3.prmtop e ns3.inpcrd. Agora que temos as coordenadas iniciais (inpcrd) e a topologia (prmtop), podemos começar a simulação propriamente dita.