Essa parte consiste de 3 etapas:

1. Preparo da estrutura cristalina
2. Complementação de resíduos não visíveis
3. Restauração da unidade biológica

Vamos trabalhar com a enzima serine protease do vírus da dengue, a proteína "não estrutural 3", NS3. Essa enzima utiliza como cofator um trecho de outra proteína não estrutural codificada pelo vírus, a NS2b.

Vamos começar com a estrutura obtida por difração de raios-x, disponível no PDB com o código 3U1I, aqui. Nessa página você encontrará detalhes sobre a estrutura, os autores, e o link para o artigo original. No lado direito da página há uma imagem da enzima e, se você clicar em "3D View", abrirá um visualizados que lhe permite manipular a estrutura. Note que unidade assimétrica existente é um dímero, contendo duas unidades biológicas completas do complexo NS3/NS2b (cadeias A/B, C/D) e, em cada unidade, está ligada covalentemente uma molécula do inibidor peptídico Bz-nKRR-H (Cadeias E e F). A estrutura contém também moléculas de água e íons fosfato. Para os cálculos de dinâmica precisaremos apenas das coordenadas de uma unidade da enzima, de forma que precisamos eliminar toda a informação extra.

Por outro lado, é importante notar que a maioria das estruturas de raios-x não inclui átomos de hidrogênio, uma vez que sua densidade eletrônica é muito baixa para ser detectado no experimento. Além disso, unidades muito flexíveis também não são visíveis. Assim, será necessário adicionar essas informações ao arquivo pois a dinâmica molecular necessita das coordenadas de todos os átomos.

Para começar, o que precisamos é dos arquivos com as coordenadas (.pdb) e a sequência (.fasta). Você encontrará no lado direito da página, acima da estrutura, o link "Download Files" e, ao clicar nesse link, aparecerá uma lista com os diversos arquivos associados à essa proteína. Faça o download dos arquivos "FASTA Sequence" e "PDB File", e coloque-os em um diretório local.

Abra o arquivo PDB (3U1I.pdb) utilizando o editor de texto de sua preferência, e gaste alguns instantes observando a informação contida. Você encontrará informações sobre os autores, publicação, método utilizado, etc. Preste atenção especial para a existência do trecho "MISSING RESIDUES", que lista resíduos que não foram detectados no experimento. Vamos voltar à essa parte em instantes.

Separação das Unidades

Como vamos trabalhar apenas com uma unidade, é conveniente separar o arquivo nos seus constituintes. No processo, vamos também remover quaisquer informação extra desnecessária. A série de comandos abaixo utiliza a ferramenta awk para separar o arquivo em seus constituintes:

$ awk '$1=="ATOM" {if ($5=="A") print}' 3U1I.pdb > ns3-A.pdb
$ awk '$1=="ATOM" {if ($5=="B") print}' 3U1I.pdb > ns3-B.pdb
$ awk '$1=="ATOM" {if ($5=="C") print}' 3U1I.pdb > ns3-C.pdb
$ awk '$1=="ATOM" {if ($5=="D") print}' 3U1I.pdb > ns3-D.pdb
$ awk '$1=="HETATM" {if ($5=="A") print}' 3U1I.pdb > ns3-A_HETATM.pdb
$ awk '$1=="HETATM" {if ($5=="B") print}' 3U1I.pdb > ns3-B_HETATM.pdb
$ awk '$1=="HETATM" {if ($5=="C") print}' 3U1I.pdb > ns3-C_HETATM.pdb
$ awk '$1=="HETATM" {if ($5=="D") print}' 3U1I.pdb > ns3-D_HETATM.pdb
$ awk '($1=="ATOM" || $1=="HETATM") {if ($5=="E") print}' 3U1I.pdb > ns3-E.pdb
$ awk '($1=="ATOM" || $1=="HETATM") {if ($5=="F") print}' 3U1I.pdb > ns3-F.pdb    

Com esses comandos, voce deve ter criado arquivos pdb separados para cada cadeia. As cadeias A e C são o cofator, as cadeias B e D a NS3, e as cadeias E e F o inibidor. As unidades biológicas se agrupam como A/B/F e C/D/E. Além disso, moléculas de água e fosfato em cada cadeia foram também separadas nos arquivos "*-HETATM.pdb" e, caso necessário, poderemos recuperar essas informações facilmente.

1. Edite o arquivo 3U1I.fasta para conter apenas a cadeia B.
2. Abra a página do Swiss-Model aqui, e clique em "Start Modelling"
3. No lado direito, sob "Supported Inputs", clique em "Upload Template"
4. De volta ao lado esquerdo, em "Target Sequence", clique no no botão verde “Upload Target Sequence File”, e escolha o arquivo com a sequencia fasta da cadeia B;
5. Em "Template File", clique no botão verde “Add Template File”, e escolha o arquivo PDB com a cadeia B;
6. Clique no botão azul “Build model”. O processo de construção do modelo pode levar até alguns minutos;

Tire alguns instantes para examinar os resultados, e conferir se está tudo como esperado. Agora você já pode salvar o arquivo PDB gerado com o trecho completo. Para isso, aponte o mouse para o botão azul "Model 1" no lado esquerdo e, no menu que aparece, selecione "PDB File". (Em alguns sistemas, pode ser necessário clicar com o botão da direita e selecionar "Salvar arquivo como ...") Você pode dar o nome que desejar ao arquivo. Aqui, vamos nos referir a ele por ns3-B_SM-orig.pdb.

Limpando o arquivo gerado pelo Swiss-Model

$ sed 's/ A / B /g' ns3-B_SM-orig.pdb > temp.pdb

$ grep ATOM temp.pdb > ns3-B_model.pdb

$ rm temp.pdb

$ tail -n 3 ns3-A.pdb 
ATOM    308  OD1 ASP A  88      36.358 -30.531  -1.161  1.00 73.95           O  
ATOM    309  OD2 ASP A  88      34.647 -29.254  -0.547  1.00 70.83           O  
TER

$ cat ns3-A.pdb ns3-B_model.pdb > ns3ns2b.pdb

TER
END